第八章外源基因表达产物的分离纯化 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 二常用的分离方法 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 四重组蛋白质的鉴定
四 重组蛋白质的鉴定 三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 二 常用的分离方法 一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 第八章 外源基因表达产物的分离纯化
、重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 ●分离纯化过程的规模化
一、 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
1.针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体; 采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选用亲和层析 进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶菌酶处理,然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白
1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析 进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白
2.针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类 开 等电点处于极端区域(pl≤5或p8)的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白; 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的;
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类 等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI型≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
3.多种分离纯化技术的联合运用 在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 ○应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
3. 多种分离纯化技术的联合运用 在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段