ELISA ELISA技术的-操作要点 ELISA技术的-操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证EL,ISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操 作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式LISA各个 操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球LSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详 细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 4.1标本的采取和保存 可用作LISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等 均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需 经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分IS检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原 和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然 凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在LIS中血 浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有 过氧化物酶活性的物质，以R即为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性RP,也会产生假 阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法LISA中可使本底加深 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清 融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和， 不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反 复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰 存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。 4.2试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。LISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的， 应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用州计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与 室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 4.3加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEIS 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可菠出，不可产生气泡
E L ISA ELISA 技术的-操作要点 ELISA 技术的-操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操 作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式 ELISA 各个 操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详 细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 4.1 标本的采取和保存 可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等 均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需 经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原 和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然 凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血 浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有 过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假 阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。 一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清 融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和， 不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反 复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰 存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见 3.2.4）。 4.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的， 应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与 室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 4.3 加样 在 ELISA 中一般有 3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染， 也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法LISA)需用稀释的血清，可在试管中按规 定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器 上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅 速完成。 4.4保温 在LISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温有(incubation)),有人称之为孵有，在ELISA中似不怡当。 ELIS属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入 板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中 的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加 入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么LISA反应总是需要一定时间的温有。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度， 也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立LISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗 原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些 试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反 应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在LISA中一般不予采用。 保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中， ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜 覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，LISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热 性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELIS板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱 中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温有，反应板均不 宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范 围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温有。室温温有时，LISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人 操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分 离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染， 也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规 定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器 上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅 速完成。 4.4 保温 在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在 ELISA 中似不恰当。 ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入 板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中 的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加 入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育。 温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和 4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度， 也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗 原抗体反应一般在 37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些 试验在 43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反 应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在 ELISA 中一般不予采用。 保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水浴箱中， ELISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜 覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热 性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱 中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不 宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范 围内，标准室温温度是指 20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人 操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5 洗涤 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分 离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是
普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在LISA操作中，洗 涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤的方式除某些LISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过 程如下 (1)浸泡式a.吸干或甩干孔内反应液：b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）：℃. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短：.吸干孔内液体。 吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干：。，重复操作c 和d,洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋 白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏 水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用， 使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓 度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 (2)流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤 时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用燕 馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且 也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流 量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6显色和比色 4.6.1显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间 仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。 适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准 确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照 孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断， 0D底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增 高。OD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。 OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。 TB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性， 宜在规定的适当时间阅读结果。TB经H即作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小
普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中，洗 涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过 程如下： （1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。 吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作 c 和 d，洗涤 3-4 次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋 白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏 水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用， 使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓 度可在 0.05%-0.2%之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 （2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤 时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸 馏水浸泡 2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且 也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流 量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6 显色和比色 4.6.1 显色 显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间 仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。 适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准 确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照 孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。 OPD 底物显色一般在室外温或 37℃反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增 高。OPD 底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。 OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。 TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性， 宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经 HRP 作用后，约 40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至 2 小
时后即可完全消退至无色。TB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可 使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。 此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450m)测读吸光值。 4.6.2比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软 板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将 软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水 或稀释液代替标本作全过程的孔)，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点， 以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 比色结果的表达以往通用光密度(oplical density,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A), 两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OD的吸收波长为492m, 表示方法为"A492nm"或“0D492nm”。 4.6.3酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读LSA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同， 各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标 有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范用、线性等等。优良的酶标仪的读数一般 可精确到0.001，准确性为士1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相 对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.0731.093)，重复测定数次，其A值均应1.083±0.05 (1.0781.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同.普通的酶标仪在0.0002.000， 新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以“*或“ovr“或其它符号表 示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.0002.900,而其线性范围仅0.0002.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。 酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在1530℃，使用前先预热仪器 15-30分钟，测读结果更稳定。 测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如0心用492m波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即 每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动LIS 板的位置。例如0PD用492nm为W1,630nm为2，最终测得的A值为两者之差(W1-2)。双波长式 测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 各种醇标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书
时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可 使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。 此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。 4.6.2 比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软 板为载体的试验，需先将板置于标准 96 孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将 软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水 或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点， 以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A）， 两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于 A 字母的右下角，如 OPD 的吸收波长为 492nm， 表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。 4.6.3 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同， 各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标 有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般 可精确到 0.001，准确性为±1%，重复性达 0.5%。举例说，若某孔测得的 A 值为 1.083，则该孔相 对于空气的真实 A 值应为 1.083±0.01(1.073~1.093），重复测定数次，其 A 值均应 1.083±0.05 （1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在 0.000~2.000， 新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900，甚至更高。超出可测上限的 A 值常以"*"或"over"或其它符号表 示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.000~2.900，而其线性范围仅 0.000~2.000，这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意。 酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15~30℃，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。 测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即 每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动 ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 为 W1，630nm 为 W2，最终测得的 A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式 测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书
4.7结果判断 4.7.1定性测定 定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出”有“或“无“的简单回答，分别用 阳性”、“阴性“表示。“阳性“表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性“则为无反应。用定性判断法 也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定 中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以 判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法ELSI中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于 阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。 (1)间接法和夹心法 这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。 但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件 不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物（见 3.6)。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。 目视法简捷明了，但领具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的 数据。先读出标本(sample,S、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值，然后进行计算。计算 方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。 a.阳性判定值 阳性判定值(cut-offvalue)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或 阴性的标准。 用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制各必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定 的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通 过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测BsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为 不含BsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9士2g/ml。每次试验设2个阳性对 照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX), 两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3个阴性对照A值均应 ≥0.5×CX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX: 如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阳性判定值=NCX+0.05 标本A值>阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中Q.O5为该试剂盒的
4.7 结果判断 4.7.1 定性测定 定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用" 阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法 也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定 中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以 判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反，阴性孔呈色深于 阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。 （1） 间接法和夹心法 这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。 但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件 不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物（见 3.6）。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。 目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的 数据。先读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算 方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。 a． 阳性判定值 阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照 A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或 阴性的标准。 用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定 的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通 过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为 不含 HBsAg 的复钙人血浆，阳性对照品 HBsAg 的含量标明为 P=9±2ng/ml。每次试验设 2 个阳性对 照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均数（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX）， 两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例 0.400），试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应 ≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算 NCX； 如有两个阴性对照 A 值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阳性判定值=NCX+0.05 标本 A 值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中 0.05 为该试剂盒的