动物免疫学实验指导 第二版 徐春厚 李淑芳 马驿编 (动物医学生物技术专业使用) 广东海洋大学教材科出版 二00七年二月二十八日
目录 实验一 凝集试验 ........... .............. 实验二沉淀试验 ...... 6 实验三溶血试验 ·9 实验四病毒的血凝及血凝抑制试验 11 实验五E-玫瑰花环试验 ·14 实验六EA玫瑰花环试验 .16 实验七EAC玫瑰花环试验 .18 实验八酶联免疫吸附试验 .19 实验九荧光抗体技术 ··21 实验十多克隆抗体（免疫血清）的制备...........23
实验一凝集试验 颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗 原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。 参与凝集反应的抗原称为凝集原(Agglutinogen),抗体称为凝集素(Agglutinin)。 细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗 原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电 挂斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了 抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此向的静电排斥力，分子间相互吸引，凝 集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待 测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。 凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求] 1.掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准 3.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂] 1.玻板，载玻片，试管(1cmx8cm),试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器， 滴头(tip头)，牙签或火柴棒，记号笔。 2.灭茵的生理盐水，灭芮的0.5%石炭酸生理盐水。 3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗 原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪） 4.鸡白荆平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] (一)试管凝集试验 以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。 1.试管准各：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。 如被检血清有多份，对照只需做1份
2.被检血清稀释：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml 0.5%石炭酸生理盐水：然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2m,加入第1管中，反 复吹吸5次混匀，吸取1.5ml弃之，再吸取0.5ml加入第2管中，混匀后吸取0.5ml加 入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml(见表1-1)。该被检血清的稀释度分别 是1：12.5、1：25、1：50、1：100。 3.对照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml,第6管加1：25稀释的布 氏杆南病阳性血清0.5ml，第7管加1：25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5ml。 4.加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5%石炭酸生理盐水作1：20稀释，每支试 管加0.5ml。 表1-1布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml) 试管号 1 2 3 45 6 7 对照管 最终血清稀释度 1:25 1:50 1:1001:200 阳性血清阴性血清 抗原 1:25 1:25 0.5%石炭酸生理盐水 2.31 0.5 0.51 0.5 0.5 被检血清 02 0.5了40.5了0.5月 0.5 0.5 抗原1：20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃1.5 年0.5 5.感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10，取出后置 室温18-24h(或37℃温箱12-14h,取出后置室温2-4h:或37℃温箱中22-24h取出)，然 后观察并记录结果。 6。结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原 被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 十十十+：100%抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡 时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。 十十十：？5%抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如 上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。 ++:50%抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集） 十：25%抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹
一：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出 现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。 7.判定标准：能使50%抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1：100，判为阳性，1：50的凝集价判为疑似反应 (可疑)：猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1：50，判为阳性，1：25的凝集价判 为疑似反应（可疑）， [注意事项] 1.实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2.结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。 对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性：牛、羊重检仍 为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。 (二)布氏杆菌病平板凝集试验 1.加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格(4cm),并注明被检血清号码，以100μL 微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第1格80μL、第2格40uL、第3格20uL、 第4格10uL。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tp头。 大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40l和20L:猪、山 羊、绵羊、狗用80μL和40μL。 2.加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30L,滴在血清附近，而不与血清接触。 从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签 抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。 3.作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃ 左右，3-5min内记求反应结果。 4.对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照 5.结果判定：按下列标准记求反应结果。 十十十十：出现大的凝集块，液体完全透明，即100%凝集。 ++十：有明显凝集块，液体儿乎完全透明，即75%凝集 十十：有可见凝集块，液体不甚透明，即50%凝集。 +：液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。 一：液体均匀混浊，无凝集现象。 ￥