第十二章现代生物技术与家畜育种 笃一芍现代生物技术概述 一、生物技术的产生与发展 生物技术这一名词诞生于1917年，是由匈牙利的一位工程师Karl Ereky提出的，当 时他提出生物技术这一名词的含意是指用甜菜做饲料大规模的养猪，即用生物将原料变 为产品。但就生物技术的开展可追溯到人类开始从事农业活动。人们有意识地利用酵母， 进行大规模的发酵生产是在19世纪。进入二十世纪以后，由于微生物的发现和微生物学 的产生，经典遗传学的建立以及化学理论和技术的出现，生物技术才被纳入科学的轨道。 经典遗传学的应用产生了遗传育种学，细胞理论和技术应用于生产，出现了细胞工程等。 1953年，Watson和Crik发现了DNA的双螺旋结构，从而奠定了现代分子生物学 的基础：1973年Boyer和Cohen建立了DNA重组技术以及随后几年对这一技术的完善 和成熟，使传统生物技术飞跃发展为现代生物技术。鉴于生物技术的迅速发展，1982年 国际合作和发展组织对生物技术这一名词的含意进行了重新定义，即生物技术是应用自 然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作反应器将物料进行加工以提高产品 来为社会服务的技术。 现代生物技术是指受DNA重组技术影响最为深刻的生物技术领域。80年代以来， 现代生物技术领域的研究和开发非常活跃，发展十分迅速（表15-1），无论在基础研究还 是在应用开发方面，都取得了显著的成就。现代生物技术已是一门分支众多、涉及多学 科的综合性技术，现代生物技术成果越来越广泛地应用于农业、医药业、工业、环保等 领域，而且现代生物技术已进入商品化。专家预测，生物技术产业将成为21世纪的支柱 产业之一。因此，世界各国政府都对生物技术非常重视，并投入巨额资金。据统计，美 国93年投资40亿美元，日本将现代生物技术作为“决策工业”列为国家优先发展的工 业，到1997年投入经费已达5000多亿日元。在加拿大政府出资1亿美元建立了生物技 术公司。由于生物技术的产业化和商品化，94年仅美国生物工程产品年销售额超过40 亿美元 二、动物育种技术及其发展 一般认为家畜的育种工作18世纪就已开始了，在长期的畜牧生产中人们已注意到品 种的重要性。现代研究结果认为，品种对畜牧生产的贡献所占的比重为45%，饲料与营 养占35%，环境与保健占25%。由此可见，优良品种在畜牧生产中是非常重要的。品种 改良的基础包活：①贵位理论，②首种技术，③种质资原。但首种技术的收进是随着贵 传理论的发展而发展。遗传学从建立经历群体遗传学、数量遗传学、发展到现在的分子 数量遗传学。育种技术也经历表型选种、表型值选种、基因型值或育种值选种、标记辅 助选择、发展到目前的分子育种。从而可以看出，生物技术的发展，育种技术和手段也 在不断改进。 1900年以前，畜禽的改良主要是表型选择，即“见好就留”。在孟德尔经典遗传学
建立和发展以后，尤其是群体遗传、数量遗传学的发展和傲机的普及和应用以来，使动 物主要经济性状的育种从表型值选择进入育种值选择，各种分子生物技术的应用，使动 物育种从群体水平进入分子水平，它可对肉、蛋、奶等主要经济性状进行基因定位，通 过参考群动物用链锁或候选基因法测定数量性状座位(QTL)的主效基因。1986年，英 国动物育种学家罗伯逊预测说，“人类应用遗传工程改变动物基因型已经为期不远了”。 经十多年的发展已被证实。DM重组技术，转基因技术，动物克隆技术，改变了常规的 基因导入的杂交方法，可按人们的要求只转入所需要的目的基因，使快速育种成为现实。 所以，生物技术的每一步发展，都伴随着新的育种技术的革命。 表15-1现代生物技术发展史上一些重要事件年表 年代 件 1917 Karl Ereky首次使用“生物技术”这一名词 1943 大规模工业生产青莓素 1944 Avery,Macleod和McCarty通过实验证明DNA是遗传物质 195 son 和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1961-1966 遗传密码破详 1970 分离出第一个限制性内切酵 1973 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1976 第一个DNA重组技术规则问世 197 DNA测序技术诞生 1978 Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1980 第一台商业化生产地DNA自动测序仪诞生 1982 第一个转基因动物诞生 1983 基因工程T质粒用于植物转化 1988 PCR方法问世 1985-1990 许多分子生物技术出现 1997 英国培育出第一个克隆羊多莉 1998 日本培育出克隆牛，英美等国培育出克隆鼠 三、动物育种中的现代生物技术 动物育种中的现代生物技术包括转基因技术、胚胎工程技术、动物克隆技术及受DNA 重组技术影响的各种分子生物技术等（图15-1）。按照常规育种方法要改变家畜的遗传特 性，如增重速度，瘦肉率，饲料利用率，产奶量等，人们往往需要进行多代杂交，选优 交配。最后培有出高产、优质、人们期望的品种。目前大多数生产上所用的家畜都是用 这种交配与选择相结合的传统动物育种的方法选育出来的。然而，这种方法的不足之处 一是所需时间长，二是一旦品种育成，再想引入新的遗传性状困难较大。因为，带有新 性状的品种可能同时也携带有害基因。杂交后有可能会降低原有性状。因此，又需重新 进行多代杂交和严格选择。多年米，杂交选择一直是改良家畜遗传性状的主要途径。随 着现代生物技术的发展，传统的杂交选择法的各种缺陷日益明显，而现代分子育种技术 却显示出越来越强大的生命力，逐渐成为动物育种的趋势和主流。通过各种现代生物技 术的综合运用，结合常规育种方法，可以大大加快育种进展。例如利用DNA导入细胞
的技术，通过胚胎工程，科学家们可以把单个有功能的基因或基因簇插入到高等生物的 基因组中去，并使其表达，再通过有关分子生物技术、DNA试剂盒诊断和检测，加以选 择，大大加快了动物育种进程。下面将对这儿种技术作以概述。 1)转基因技术 2)M胎工程技术 家畜生物技术 3)动物克隆技术 4)各种分子生物技术 图12-1动物育种中的现代生物技术 第二节转基因动物技术 一、转基因动物的概念 动物转基因技术是将外源DNA导入性细胞或胚胎细胞并生产出带有外源DNA片段 动物的一种技术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。1981年Gordon和Ruddle 首次用显微注射法(microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精 卵植入假孕母鼠子宫，产生了78只小鼠，其中有2只小鼠的所有细胞中（包括生殖细胞） 都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转 基因小鼠(transgenic mice),自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物 (transgenic animal). 二、转基因动物技术的一般步骤 转基因动物技术是把单个有功能的基因或基因簇导入动物的基因组中去，并使其后 代能够得到表达的一种操作技术。它是DNA重组技术在动物中的应用。生产转基因动 物的步骤包括： (1)选择能有效表达的蛋白质： (2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因： (③)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列： (4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况： (⑤)把拼接的基因引入到受精卵的细胞核中： (6)把引入后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发育： (⑦)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传 递情况。部分后代细胞携带有转入的外源基因，利用这些动物培育新的品系。 在这个技术中涉及到基因工程技术、胚胎生物工程技术和分子诊断等技术。其关键 是目的基因的选择和提高外源基因导入的成功率。步骤(1)到(4)涉及到基本的基因 工程的基本技术，在此不再作叙述。 三、导入基因的方法
导入外源基因的方法有多种，除在上一节叙述的方法外，还有微注射法、精子载体 法、胚胎干细胞(ES)介导法和染色体片段注入法等：在转基因动物中，DNA微注射法 比较常用。 (一)显微注射法 显微注射法(microinjiection)是在显微注射仪上将 外源DNA直接注入细胞。用一支口径很小的吸管将受 精卵固定，再将另一吸管插入受精卵直接注入外源基 因，接着移植到受体动物的子宫，完成发育过程（图 15-2)。为了减少细胞的损伤，吸管以非常小的角度逐 渐变细。原核膨胀表明基因己注入原核。如果将外源 基因注入细胞质内，只有核膜消失时外源基因才有机 会与受体细胞基因相结合。所以，注射到细胞质中的 外源基因整合率很低，只有注射到原核内才能提高整 合率。现已有人将基因注入卵母细胞核内，再让卵母 细胞体外成熟，体外受精，由于卵细胞核较大，可以 图12-2通过微注射生产转基因动物示意图 大大的提高转化效率。这种方法的优点是不但可以控 制注入DNA的量，而且可以把外源DNA注入细胞的不同部位，但是需要逐个操作每 个细胞。因而无法进行批量处理。 迄今为止，人们已利用此将胸苷激酶基因、生长激素基因和鼠m℃基因转入了哺乳 动物细胞。这种方法不仅可以获得转基因动物所用的转基因动物细胞，而且也可以通过 哺乳动物细胞来生产有用的蛋白质。 小鼠和兔的受精卵原核在普通显微镜下容易看到，而绵羊，尤其是猪和牛的卵细胞 质稠密，不能看到原核。Hammer等用干涉相差显微镜可观察到80%的绵羊卵核，而猪 和牛的卵子需经离心处理再用干涉相差显微镜才能观察到卵原核，离心处理后的多数受 精卵仍能正常发育。 (二)精子载体法(sperm as vector) 当前转基因动物生产的方法劳动强度大，费用高，而新的简化程序的技术则能使转 基因动物的工作获益很大。近年来利用精子作为外源基因的载体来生产转基因动物令人 注目。采用的方法是，将成熟的精子与带有外源DNA的载体进行共培有之后，使精子 有能力携带外源DNA进入卵中，使之受精，并使外源DNA整合于染色体中。Bracet等 (1971)将家兔精液和放射性标记的SV40病毒DNA解育后，在精子头部能够检测到放射 活性，病毒DNA在受精过程中被带入了卵细胞：Lavitravo等(1989)把质粒与小鼠的附翠 精子共孵育30mi,进行体外受精和移植，结果获得250个后代中，30%的为阳性，部 分小鼠表达了CT基因并传代到F,。这一方法在转基因鼠上的应用使人们看到转基因动 物效率提高的希望。 影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的关键性因素，首先哺乳动物精子吸
附外源DNA需特定的时期：其次精子吸附DNA时精子活性及DNA性质都受影响。 利用精子作为基因转移的工具，在实践中存在许多问题，但此技术至少在构思上， 对于大动物转基因研究具重要意义。 (三)胚胎干细胞(ES)介导法 胚胎干细胞(embryonic stem cel)是从胚泡中将 举翻感餐 内细胞团取出在体外培养建立的，在培养时保持了它 的正常核型。胚胎干细胞注入寄主胚泡后，参与胚胎 。o 形成，进入嵌合体动物的生殖系统。用DNA转染法 或反转录病毒介导法可将基因导入胚胎干细胞，选出 带有目的基因的细胞克隆，然后导入受体胚胎（图 15-3)。然而由此法生成的后代都是嵌合体，若由这 移植到导体子雪 些嵌合体胚胎中再分离出干细胞，用核移植技术将其 ov 细胞核植入无核卵细胞，这样可以提高转基因的效围12-3E6细胞介导的转基因动物生产 旁 (四)染色体片段显微注入法 染色体介导法是指从人或动物染色体上割取特定的染色体片段M期)或分离出来之 后，以其为媒介将外源基因注入动物早期胚胎中，以获得外源DNA的动物，严格地讲 称为转染色体动物。通常人们采用离心分离法或流式细胞仪(ow cytometry)分离法分离染 色体 尽管目前该技术应用因难较大，且成功率很低(0~0.002%)，但由于它具有不需经基 因重组就可转移超大型外源DNA(大于100Okb)之独特优点，适于多基因转移。鉴于本法 导入的遗传信总片段长，能生产出具备某些特殊疾病的实验动物模型。 四、转基因动物检测的方法 以转基因鼠为例，说明转基因动物检测的方法。经转基因步骤获得的仔鼠出生后采 样提取DNA。将制备好的DNA样品点到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用所注射的基因 作成探针，作斑点杂交，检测出带有外源基因的小鼠。然后采集血样或外源基因表达的 器官组织用以制备RNA:用外源基因作为探针与制备的RNA进行Northern分子杂交， 检查外源基因是香转录成mRNA。接着对带外源基因的小鼠进行放射免疫测定，以检测 由外源基因合成的蛋白质。可用原位杂交法测出外源基因在染色体上的整合部位，还可 将带外源基因的小鼠进行繁殖，检查基因是否进入生殖系统，以及在后代中的传递情况。 对其它动物除了收集受精卵的方式，注射外源基因和胚胎移植不同之外，其余的检测方 法都是相同的