河南师范大学 第6章吸光光度法 教学目的：掌提光度法的基本原理，了解光度分析件的控制，分光光度 法的应用范围。 教学重点：Beer定律：光度分析的应用。 教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。 吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分折方法，包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1概述 6.1.1吸光光度法的特点 1,光的基本性质 紫外光：200-400nm可见光：400-750nm红外：0.75-50um 单色光：单一波长的光。复合光：由不同波长的光组成的光。 互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见216。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色 两互补色按一定比例混合后，可得到白色。 2。吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收其有 洗择性。分子能级图，D215.图6一1。 吸收光谱曲线：A~C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处 测定吸光度，则灵敏度最高。 a.max与c无关b.Axc 6.1.2光吸收的基本定律 1.朗伯一比尔定律 1760年，Lambert用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852年，Beer研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度：A=lg兰=Kbc透光率：T= 4=lg2=lg月 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收（光）系数 A=Kbc b:cm c:mol/L A=bc8:摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：Lcm.o1 物理音义： 定2下，b=1cm,c=1mol/L时的吸光度 实际工作中不能用c=101/L的溶液测吸光度(A=0.2-0.7)。能反映方法的灵 度，光度法测定8：10，一般e:10己很灵敏。 (2)桑德尔灵敏度指数：S(g/cm) 在m阳x时，A=0.001下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含最。 6-1
河南师范大学 第6章 吸光光度法 教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度 法的应用范围。 教学重点：Beer 定律；光度分析的应用。 教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。 吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1 概述 6.1.1 吸光光度法的特点 1．光的基本性质 紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50μm 单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。 互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见 p216。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。 两互补色按一定比例混合后，可得到白色。 2．吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图，p215，图 6－1。 吸收光谱曲线：A∼C 曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处 测定吸光度，则灵敏度最高。 a.λmax 与 c 无关 b. A∝c 6.1.2 光吸收的基本定律 1． 朗伯－比尔定律 1760 年，Lambert 用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852 年，Beer 研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度： 0 lg I A Kbc I = = 透光率： 0 I T I = 0 1 lg lg I A I T = = 2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 （1）摩尔吸收（光）系数ε A＝Kbc b：cm c：mol/L A=εbc ε:摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1.mol-1 物理意义：一定λ下，b＝1cm，c＝1 mol/L 时的吸光度。 实际工作中不能用c＝1 mol/L的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。ε能反映方法的灵敏 度，光度法测定ε：104 ，一般ε:105 已很灵敏。 （2）桑德尔灵敏度指数：S （μg/cm2 ） 在λmax 时，A=0.001 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。 6－1
河南师范大学 S与6的关系：A=0.001=bc,bc=0.001/e Sb(Cm)xc (mo1/ds)xM(/1)10/.001xMx (u/c) K例>e“与邻二氮菲生成红色络合物，=1.1x10, 灵敏度高 Fe与磺基水杨酸络合物，c=5.8x×103, 双硫腙与Pb的6=6.8×10，S=M/6=207/6.8×10-=0.0030(μg/cm) 双硫踪与Cu的e=4.52×10,S=M/e-63.5/4.52x10-0.0014(ug/cm灵敏度高 3.吸光府的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为 A,则总吸光度为 =A+A+.+A (据此可进行多组分的测定) 6.1.3比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下品色，目视比较 特点：灵敏度 准确度低 ,不同人看，结果不同，不符合朗伯一比尔定律也可用目视 比色法 因为比较的是透过光 2.光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比日视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光 片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4.分光光度计及其基本部件：光源一单色器一比色皿（吸收池）一检测器一显示器 (1)光源钨丝灯：可 、红外400-1000nm氢灯或氘灯：紫外160-350m (2)单色器 a.滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b。棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜：可见，石英棱镜：紫外、可见 C,光：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/m 衍射、 干涉原理 (3)吸收泄 玻璃： 可见。 石英：紫外 可 (4)检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光 照产生光电流，测定光电流的大小。 (5)显示器：检流计：72型。数字显示：722型。数字打印：V一240。 6.2光度分析法的设计 62.1显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M十L=如 1.要求：(1)选择性好：(2)灵敏度高，ε>10：(3)有色化合物L要稳定，不分解： (4)M的组成要一定（只ML无M):(5)ML与L颜色差别大，吸收峰波长差：△>60nm 2.显色剂：满足以上要求。有机显色剂 6.2.2昆色条件的洗摇 1.溶液的酸度 M十L=ML(显色剂L存在酸效应m) a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 c.影响M的组成和稳定性，如Fe艹一磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1:1 紫红 4-8 1:2 棕褐 8-10 1:3 黄色 2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。 3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。 6-2
河南师范大学 S 与ε的关系：A＝0.001＝εbc，bc＝0.001/ε S=b(cm)×c(mol/dm3 )×M(g/mol)×106 μg/g＝ 3 0.001 10 M M ε ε × × = (μg/cm2 ) <例>Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，ε＝1.1×104 ， 灵敏度高 Fe2+与磺基水杨酸络合物，ε＝5.8×103 ， 双硫腙与Pb的ε＝6.8×104 ，S＝M/ε＝207/6.8×104 =0.0030(μg/cm2 ) 双硫腙与Cu的ε＝4.52×104 ，S＝M/ε＝63.5/4.52×104 =0.0014(μg/cm2 ) 灵敏度高 3．吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1，A2，.An，则总吸光度为： A=A1+A2+.+An （据此可进行多组分的测定） 6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。 特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律也可用目视 比色法，因为比较的是透过光。 2.光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光 片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4.分光光度计及其基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器 （1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm 氢灯或氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器 a． 滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b． 棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 c． 光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理 （3）吸收池：玻璃:可见, 石英:紫外、可见 （4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光 照产生光电流，测定光电流的大小。 （5）显示器：检流计：72 型。数字显示：722 型。数字打印：UV－240。 6.2 光度分析法的设计 6.2.1 显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML 1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，ε>104 ；（3）有色化合物ML要稳定，不分解； （4）ML 的组成要一定（只 ML 无 MLn）；（5）ML 与 L 颜色差别大,吸收峰波长差：Δλ>60nm. 2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂 6.2.2 显色条件的选择 1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂L存在酸效应αL（H）） a． 影响显色剂的溶度 b． 影响 M 的存在状态 c． 影响ML的组成和稳定性，如Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色 2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。 3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。 6－2
河南师范大学 4.溶剂：一般鳌合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SC)”在水中 大部分离解，几乎无色：在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时 6。干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰：生成无色络合物，负干扰 干扰的消除： (1)制一定酸度，使干扰组分不生色。 (2)拖蔽剂，与干扰组分生成无色物 3) 洗择活当的被长 (4) 选择适当的参比液 (5) 分离干扰组分 6.2.3测量波长和吸光度范围的选择 1.测量波长的选择 (1)“最大吸收原则：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。无干扰)2)吸收最大， 扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图6 2.吸光度范围的选择：A:0.2-0.8(T为65%-15%)（相对误差较小） 6.2.4参比溶液的选择 1.M、L均无色，可用蒸馏水作参比。 2.L无伍，M有色，可用不加昆鱼剂的被测试液作参出溶液 3.L有色，M无色， 可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液 4.L、M均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色 剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。 5.改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 6.2.5标准曲线的制作 配制一系列标准溶液，作A一曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出 63 光度分析法的误差 6.3.1对朗伯-比尔定律的偏 1.非单色光 d==,I=10-ok lot =c:be=lg,=10-9k A按电 I+Io 若G=,则A=6bC,若6≠，A与c不成线性关系 2.介质不均匀引起的偏离 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2吸光度测量的误差 光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差△T为定值 定的△,对应的△c不同，相对误差△c/c不同。 c小，△1起的△c小，△c/c大：c大，△起的△c大，△c/c大。 AlgT-0,434nTdA=0434drh-0434T-0434d T A TU-lgT)TUgT 6-3
河南师范大学 4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)4 2－在水中 大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。 6．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除： （1） 制一定酸度，使干扰组分不生色。 （2） 掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。 （3） 选择适当的波长。 （4） 选择适当的参比液 （5） 分离干扰组分 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1．测量波长的选择 (1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大， 干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图 6－7 2. 吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T 为 65%-15%）(相对误差较小) 6.2.4 参比溶液的选择 1．M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。 2. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 3. L 有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4．L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色 剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。 5．改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 6.2.5 标准曲线的制作 配制一系列标准溶液，作 A－c 曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。 6.3 光度分析法的误差 6.3.1 对朗伯－比尔定律的偏离 1．非单色光 1 2 1 2 01 02 1 1 01 2 2 2 02 1 2 01 02 01 02 1 2 01 02 lg , 10 lg , 10 A lg lg A A c 10 10 bc bc bc bc I I A bc I I A bc I I I I II II II I I ε ε ε ε ε ε εε ε ε ε − − − − == = == = 1 2 1 2 ≠ ＋ ＋ ＝ ＝ 若 ＝ ，则 ＝ bc,若 ， 与 不成线性关系 ＋ ＋ 2．介质不均匀引起的偏离 3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2 吸光度测量的误差 光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差ΔT 为定值。 一定的ΔT，对应的Δc不同，相对误差Δc/c不同。 c小，ΔT引起的Δc小，Δc/c大；c大，ΔT引起的Δc大，Δc/c大。 0.434dT dA 0.434dT 0.434dT A=-lgT=0.434lnT dA=- =- = T A T (-lgT) T lgT 相对误差： 0.434 lg c A dA dT RE c A A TT Δ Δ == == 6－3
河南师范大学 6.4其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1.原理（高浓度示差吸光光度法） 选用比cx浓度稍小的c为参比，调透光率100%，相当于标尺扩大10倍。 么=EC8到=4m=AM=4-4=b6-6)=6bac=6cw定量基瑞：AM=6b(化-6)=6bac a.先做△A-Ac标准曲线：b.测待测溶液的△A:c.从标准曲线查出相应的△c:d.cx=cO+△c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果：G,±C,·x%,示差光度法结 果：c±(c-a)% 6.4.2双波长吸光光度法 1.原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2.应用：(1)混浊试液中组分的测定：(2)单组分的测定：(3)两组分共存时的分别测定。 6.4.3酸（碱）离解常数的测定 HB H*+B 在某波长入下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B均有吸收，液层厚度b=1cm)则 cw[H:】 A=HB]+s[B]=eK,+H问sK,+H阿 AHw=EHBC,Ag=Erc→pK。=plH-lg (A-A-) 6.4.4络合物组成的测定 (1)饱和法（又称摩尔比法） (2)连续变化法（又称等摩尔系列法） 固定一种组分（通常是金 CMCRFC,改变cM和cR的相对量， 属离子M0的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物 剂（®）的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/0比值不同的溶液， 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 Rn浓度最大时，cRcW比值为n。 参比液，分别测定其吸光度。 当cc为0.5时，络合比为1：1： 以吸光度A为纵坐标，[R]/M)为横坐标作图 当cc为0.33，络合比为1：2 0.5 0.4 8 0.1 [RVIM) "m848888 0.0 图6一16饱和法 图6一17生续变化法 作业：P3,5,6Pa98,11,12P2015,17,19 6-4
河南师范大学 6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1．原理(高浓度示差吸光光度法) 选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 } 0 0 ( ) ( ) 0 0 0 , x x x x x A cb A A A A b c c b c bc A bc c bc A cb ε ε εε ε ε = ⇒ = Δ = − = − == Δ = Δ= − = Δ = 相对 相对 定量基础： ε x a.先做ΔA~Δc 标准曲线；b.测待测溶液的ΔA；c.从标准曲线查出相应的Δc；d.cx=c0+ Δc 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x%普通光度法结果：c c x x ± ⋅ % ±−⋅ c x ，示差光度法结 果：c c x x ( ) 0 % 6.4.2 双波长吸光光度法 1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2．应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。 6.4.3 酸（碱）离解常数的测定 HB = H+ + B－ 在某波长λ下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B－ 均有吸收，液层厚度b=1cm）则 [ ] [] [ ] [ ] [ ] ( ) ( ) , l HB HB a HB B B HB a a HB HB HB B B a B c H c K A HB B KH KH A A A c A c pK pH A A ε εε ε ε ε − − − − − + − + + = += + + + − = = ⇒ =− − g 6.4.4 络合物组成的测定 （1）饱和法(又称摩尔比法) （2）连续变化法(又称等摩尔系列法) 固定一种组分(通常是金 cM+cR=c，改变 cM和 cR 的相对量， 属离子 M)的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物 剂(R)的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/[M]比值不同的溶液， 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 MRn 浓度最大时，cR/cM 比值为 n。 参比液，分别测定其吸光度。 当 cM/c 为 0.5 时，络合比为 1:1； 以吸光度 A 为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。 当 cM/c 为 0.33，络合比为 1:2； 作业：P238 3, 5, 6 P239 8, 11, 12 P240 15, 17, 19 6－4